Uvod

Krajem prosinca prošle godine u gradu Wuhanu, pokrajna Hubei u Narodnoj Republici Kini, zabilježeni su prvi slučajevi atipične upale pluća nepoznate etiologije (1). Kao izvor zaraze, epidemiološki je prepoznata tržnica morskim plodovima i drugim životinjskim proizvodima u navedenom kineskom gradu. Vrlo brzo, početkom siječnja 2020. godine identificiran je uzročnik bolesti, virus iz grupe beta coronaviridae (lat. Corona kruna- na koju podsjeća vanjska omotnica virusa sa šiljastim proteinskim izdancima, Slika 1) (2). 

Tržnica je zatvorena, uvedene su stroge mjere socijalnog distanciranja uz karantenu u navedenoj kineskoj pokrajini, te su obaviješteni Svjetska zdravstvena organizacija (SZO) i međunarodna javnost. Do toga trenutka broj identificiranih bolesnika u Kini iznosio je 27, još bez smrtnih slučajeva. U međuvremenu, broj bolesnika i smrtnih slučajeva u Kini se eksponencijalno povećavao, epidemija se proširila na sve kontinente, te je SZO proglasilo prvo globalnu epidemiološku prijetnju, a potom, 11. veljače, stanje pandemije (3). SZO je u nomenklaturi novootkriveni koronavirus označila najprije kao 2019-nCoV (2019- novel corona virus), a potom dodijelila naziv SARS-CoV-2, zbog strukturalne sličnosti (genetska homologija iznosi 80%) koronavirusu SARS-CoV (eng. Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus) (4), koji je 2003. godine izazvao epidemiju atipične upale pluća s najvećim brojem zaraženih osoba uglavnom na teritoriju Kine (5). Nekoliko godina kasnije odnosno 2008. godine, relativno ograničeno u području bliskog Istoka, pojavila se nova epidemija atipične upale pluća, a uzročni koronavirus nazvan je prema mjestu pojave Middle East Respiratory Syndrome Corona Virus (MERS-CoV, djeli 50% genetsku homologiju sa SARS-CoV-2) (6). Prema zadnjim spoznajama, porijeklo sva tri koronavirusa je iz šišmiša (prirodni rezervoar nekoliko vrsta koronavirusa) (7), od kojih se virus proširio u druge životinje (tzv. intermedijarni domaćini; u SARS-CoV divlja mačka cibetka, u MERS-CoV u jednogrbe deve, a u SARS-CoV-2  u ljuskavcima), u kojima je mutacijama i prilagodbom zadobio potencijal prelaska na ljude i širenja među ljudima (8).  Zajedničko svim navedenim epidemijama koronavirusa je klinička slika atipične upale pluća. Epidemiološki, razlika između ove tri epidemije je u geografskoj rasprostranjenosti i broju zaraženih i umrlih. Najveći potencijal širenja među ljudima od ova tri koronavirusa pokazuje SARS-CoV-2 s reprodukcijskim faktorom (Ro) u prosjeku 2,3 (čime je definiran prosječan broj ljudi kojima jedna zaražena osoba može prenijeti virus) (9). Broj zaraženih ljudi u epidemiji SARS-CoV 2003. godine iznosio je oko 8000 uz 770 umrlih, a u MERS-CoV 2008. godine 2500 zaraženih i 800 umrlih. U trenutku pisanja ovog teksta, broj zaraženih ljudi sa SARS-CoV-2 premašio je 5 milijuna uz broj umrlih preko 330 tisuća (u Hrvatskoj više od 2200 zaraženih te 100 preminulih, mortalitet oko 4%), što predstavlja najveću pandemiju još od razdoblja španjolske gripe iz 1918. godine, uz neprocjenjiv utjecaj na zdravstveni i ekonomski sustav velike većine zemalja.  

Uloga renin-angiotenzinskog sustava u upalnom odgovoru i razvoju COVID-19

Vremenski tijek otkrivanja pojedinih komponenti renin-angiotenzisnkog sustava (RAS)  prikazan je na Slici 2. (10).  Pojedine komponente RAS (renin, angiotenzin konvertirajući enzim- ACE) poznate su relativno dugo, dok je angiotenzin konvertirajući enzim 2 (ACE2) identificiran 2000. godine od strane dvije grupe autora. ACE2 je transmembranski protein široko rasprostranjen u tkivima i organima, pripada grupi cink metaloproteinaza i pokazuje 40%-tnu homologiju ACE (11, 12).  Za razliku od ACE,  ACE2 kodiran je genom na X kromosomu, posjeduje jedno katalitičko mjesto (ACE posjeduje dva katalitička mjesta), ne razgrađuje bradikinin i nije podložan inhibiciji ACE blokatorima (ACEB) (11). N-terminalni (izvanstanični) dio ACE2  je receptorsko mjesto molekule (13, 14). Karboksi-terminalni (unutarstanični) dio enzima strukturno je homologan kolektrinu, bjelančevini koja je zadužena za usmjeravanje prenosioca aminokiselina u epitelnim stanicama. ACE2 kao mono-karboksipeptidaza razgrađuje brojne peptide: apeline, opioide, angiotenzine, kinine (15). 

U kontekstu RAS-a, ACE2 razgrađuje angiotenzin I (ATI) u angiotenzin-(1-9) (AT(1-9)) i angiotenzin II (ATII) u angiotenzin-(1-7) (AT(1-7)) (12).  Receptor za AT(1-9) je tip 2 angiotenzinskog receptora (ATIIR2), a za AT(1-7) Mas receptor (MasR) (Slika 3).

U nedavnim radovima dokazano je da SARS-CoV-2 dijeli zajedničke molekularne i stanične mehanizme sa SARS-CoV i MERS-CoV (16), uključujući zajednički put ulaska u stanicu, a to je vezanje S glikoproteina (eng. spike, šiljak) virusne ovojnice za receptorsko mjesto u ACE2 (Slika 3) (17). Receptorsko mjesto vezanja S proteina ovojnice koronavirusa na ACE2 razlikuje se od aktivnog katalitičkog mjesta enzimske razgradnje peptidnih prekursora.

Genomska sekvencija SARS-CoV i SARS-CoV-2 razlikuje se u rasporedu 380 aminokiselina, odnosno u 5 od 6 aminokiselina zastupljenih u receptorskoj domeni S proteina (18). Te promjene uvjetuju jaču hidrofobnost receptorskog mjesta te 10 puta jaču prijemčljivost SARS-CoV-2 za ACE2 u odnosu na SARS-CoV (19). Uz ACE2, pronađene su i koreceptorske molekule za SARS-CoV-2, prvenstveno transmembranska serin proteaza 2 (TMPRSS2) (20). Interakcija S glikoproteina virusa s ACE2 dovodi do konformacijske promjene S proteina koji time postaje supstrat TMPRSS2 (20). Preradbom S proteina dolazi do fuzije stanične membrane domaćina i ovojnice virusa, a TMPRSS2 proteolitičkim djelovanjem posreduje endocitozu kompleksa ACE2-SARS-CoV-2.  Nakon internalizacije, virus se unutar stanice odvaja od ACE2 u lizosomima aktivacijom nekoliko proteaza  (katepsin B i L, tripsin, furin, faktor X)  (Slika 3).  Postoji i drugi, izvanstanični put proteolize ACE2, kojeg posreduju proteaza ADAM17 (disintegrin and metalloproteinase 17) i peptidni sustav apelina (21-23). Osim o ekspresiji ACE2, organotropnost koronavirusa vjerojatno barem djelomično ovisi i o ekspresiji navedenih akcesornih receptorskih sustava u pojedinim organima (20).

S terapijskog stajališta, interesantan je pokušaj blokiranja ulaska virusa u stanice primjenom inhibitora navedenih koreceptorskih molekula. U animalnim studijama, inhibitori ADAM17 (u tu svrhu korišten je parakalcitol, sintetski vitamin D) i inhibitori TMPRSS2 (kemostat-mesilat), te agonisti apelinskih receptora, pokazali su porast ekspresije ACE2, spriječili internalizaciju virusa i induciranu upalu pluća (24-26). U Japanu je trenutno kliničko istraživanje primjene antagonista TMPRSS2 na ekspresiju ACE2 (27).

Primjenom mRNA sekvencijskih metoda, utvrđena je zastupljenost ACE2 u mnogim tkivima i organima (Slika 4) (28). U plućima SARS-Co-V2 veže se na ACE2 u pneumocitima tipa 2, makrofazima te trepetljikastom epitelu dušnika i dušnica. Najveća tkivna ekspresija ACE2  nađena je u epitelnim stanicama tankog crijeva, te u bubrežnim epitelnim stanicama gdje je gotovo 100 puta veća nego u epitelu pluća (Slika 4) (28). Premda rezultati istraživanja na životinjama upućuju na pad tkivne aktivnosti ACE2 proporcionalno dobi, nedavna ispitivanja na ljudima pokazala su da ekspresija ACE2 nije ovisna o dobi, spolu i rasi (29). Također, polimorfizam ACE2 gena nije bio povezan s različitom sklonošću za infekciju (30).

Uloga RAS-a u fiziološkim uvjetima prvenstveno se odnosi na regulaciju tjelesnih tekućina,  ravnotežu vode i soli, regulaciju acidobaznog sustava, krvnog tlaka i kontrolu upale. ACE2 utječe na homeostazu RAS-a održavanjem ravnoteže učinaka dviju osovina, ACE/ATII/ATIIR1 i ACE2/AT(1-7)/MasR (31). Na razini krvnih žila, ATII djeluje primarno vazokonstriktorno, međutim u brojnim patološkim stanjima, pokazuje proupalno i profibrotsko djelovanje. AT(1-7) djeluje suprotno: pokazuje antiagregacijska svojstva, posreduje vazodilataciju, smanjuje razinu slobodnih kisikovih radikala, apoptozu i upalu.

U eksperimentalnim modelima na životinjama i u in vitro pokusima, ustanovljeno je da ulazak i multipliciranje SARS-CoV u epitelu pluća dovodi do snažnog smanjenja ekspresije ACE2 na površini stanica (32, 33). Na taj način, za vrijeme infekcije na stanicama gubi se učinak razgradnje ATII, uz posljedični proupalni lokalni porast koncentracije ATII u mnogim tkivima (33, 34). Visoke koncentracije ATII djeluju kemotaktično na neutrofile i mijenjaju odnos Th17/Treg subpopulacije limfocita. Gubitak ravnoteže sustava ACE/ACE2, odnosno pad ekspresije ACE2, dokazan je u eksperimentalnim modelima ateroskleroze (35), bakterijske i virusne upale pluća (33, 36-38), srčanog popuštanja i infarkta (36, 39, 40), te akutnog nekardiogenog plućnog edema (ARDS) (33,36). Lipopolisaharidi smanjuju ekspresiju ACE2, što je mogući mehanizam dodatnog pogoršanja virusne upale pluća superponiranom bakterijskim infekcijiom (38). Upalni biokemijski obrazac oksidativnog stresa i tzv. citokinske oluje u animalnim pokusima bilo je moguće blokirati farmakološkom intervencijom na RAS, primjenom blokatora ACE (ACEB), ATIIR1 (ARB), agonistima MasR te rekombinantnog humanog ACE2 (rhACE2) (32, 33, 38-41).

Povećan morbiditet i mortalitet COVID-19 pacijenata nađen je u osoba s hipertenzijom, srčanim bolestima i šećernom bolesti, koje ujedno predstavljaju stanje disbalansa RAS-a (42). Disfunkcija (smanjena ekpresija) ACE2 pokazuje važnu ulogu u patofiziologiji srčanog popuštanja, hipertenzije, infarkta miokarda i kardiovaskularnih komplikacija u dijabetičara (43). Reducirana razina ACE2 nađena je i u srčanim eksplantantima nakon transplantacije srca zbog dilatativne kardiomiopatije, te u humanim postmortem istraživanjima miokarda u epidemiji SARS-CoV (44, 45). U istraživanjima pacijenata s COVID-19, dokazano je povišenje razine ATII sukladno težini plućnog oštećenja (46). Reddy i suradnici u grupi 39 bolesnika s ARDSom, ispitivanjem metaboloma, među preživjelima utvrdili veći omjer AT(1-7)/ATII i AT(1-9)/ATII (47). U pilot projektu Khana i suradnika, u bolesnika s ARDS-om, primjena rhACE2 dovela je do sniženja serumske razine ATII (48). U jednoj manjoj kliničkoj studiji, pokazano je da je plućna hipertenzija povezana sa smanjenom plućnom ekspresijom ACE2, no nakon peroralne primjene rekombinantne humane ACE2 (rhACE2), zamijećeno je poboljšanje plućne hemodinamike uz pad upalnih parametara (49). U svjetlu gore navedenih činjenica, trenutno su u kliničkim istraživanjima pokušaji liječenja COVID-19 primjenom rhACE2 kao kompetitivnog inhibitora SARS-CoV-2 (NCT04287686).

ACE2 osim u regulaciji RAS-a, sudjeluje u metaboličkim procesima

ACE2 osim u regulaciji RAS-a, sudjeluje u metaboličkim procesima (Slika 5). U pokusima na animalnim modelima pokazano je da ACE2/AT(1-7) u masnom tkivu potiče konverziju upalnih M1 makrofaga u protuupalnu M2 subpopulaciju, te na taj način potiče gubitak masnog tkiva i mršavljenje (50). Drugi primjer je stimulacija transportera aminokiselina u proksimalnim tubulima bubrega i u epitelu tankog crijeva, zatim ekspresija bakterijskih antigena i regulacija mikrobioma  (51). Zanimljivi koncept povezuje kroničnu upalu, SARS-CoV s disbiozom i poremećajem mikrobioma. Naime, SARS-CoV detektiran je u fecesu u 70% oboljelih pacijenata, a također je dokazana i prisutnost SARS-CoV-2 i to najviše u enterocitima ileuma (52). Padom ekspresije ACE2 na enterocitima nakon vezanja S proteina SARS-CoV, dolazi do strukturnog i funkcionalnog slabljenja barijere krv- sluznica crijeva, čime nastupa pojačana translokacija bakterija i endotoksina u cirkulaciju (53). Ovim mehanizmom pojačava se sistemski upalni odgovor, uključujući oštećenje u plućima, što se naziva osovinom crijevo-pluća. Pacijenti s pozitivnim nalazom fecesa na SARS-CoV imali su težu kliničku sliku i lošiju prognozu (52). Pored toga, zamijećeno je da se virus u fecesu može zadržati i do tri tjedna, što ne iznenađuje, uzevši u obzir da je upravo sluznica crijeva mjesto najveće ekspresije ACE2 u organizmu (Slika 4), a također, ovaj podatak dodatno utječe na strategiju izolacije SARS-CoV-2 pacijenata.

Za SARS-CoV pokazano je da može inducirati šećernu bolest, indirektno mehanizmom inzulinske rezistencije, ali i neposredno djelujući na beta stanice Langerhansovih otočića (54). Ekspresija ACE2 u bubrežnim tubulima glodavaca s induciranom šećernom bolesti je značajno smanjena, a primjenom rhACE2 dolazi do značajnog oporavka bubrežne funkcije (55). Slično je primjećeno i u istraživanim modelima s Alportovim sindromom (56). U kliničkim istraživanjima, zamijećeno je da je retinopatija značajno rijeđa u bolesnika sa povišenom razinom mRNA ACE2 i MasR, pa čak ako su imali i dugogodišnju loše reguliranu glikemiju (57). To se tumači prvenstveno djelovanjem AT(1-7) na matične stanice koštane srži u kojima se potiče stvaranje angiogenih CD34+ stanica.

Klinička slika, patofiziologija i laboratorijske karakterisitke COVID-19

Bolest, odnosno klinički sindrom uzrokovan SARS-CoV-2 definiran je kao COVID-19. Primarni put širenja bolesti je kapljičnim putem, sluznicama, izravnim kontaktom, npr. rukovanjem. Razdoblje inkubacije traje 1 − 14 dana, prosječno 3 − 7 dana. Identifikacija SARS-CoV-2 moguća je iz različitih tjelesnih tkiva i tekućina. Osim brisa ždrijela i bronhoalveolarnog lavata, virus je izoliran iz krvi, urina, fecesa (53, 58, 59). Postupan razvoj kliničke slike obilježen je s tri patofiziološke faze koje odgovaraju tijeku kliničke slike (Slika 6) (60, 61).

U prvoj fazi virusne upale, proliferacija virusa u plućnom epitelu uzrokuje aktivaciju urođene imunosti odnosno proliferaciju monocita i makrofaga, što je popraćeno općim algičkim sindromom i febrilitetom. U sljedećoj fazi, kemotaksija i aktivacija leukocita uz otpuštanje upalnih čimbenika dovodi najprije do vazodilatacije i povećane permeabilnosti krvnih žila. Ako se upala nastavi, nastupa kritična faza obilježena hiperaktivnošću imunološkog odgovora praćenog masovnim oslobađanjem upalnih medijatora (interleukina (IL)-6, IL-2, IL-7, tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon-γ, inducible protein (IP)-10, monocyte chemoattractant protein (MCP)-1, macrophage inflammatory protein (MIP) 1-α, granulocyte-colony stimulating factor  G-CSF), pojava poznata pod nazivom citokinska oluja, koja se klinički očituje multiorganskim zatajenjem (MOF) (62, 63).

Asimptomatski i blagi oblici bolesti (slični kliničkoj slici sezonske gripe) čine 80% oboljelih, umjereno težak oblik bolesti (upala pluća s ili bez potrebe za oksigenom terapijom) javlja se u 15% oboljelih, a najteži oblici bolesti (razvoj ARDS-a i/ili sepse) u 5% oboljelih (64).

U retrospektivnoj studiji Zhou i suradnika prezentirani su demografska obilježja, klinička slika, laboratorijski pokazatelji, vrsta komplikacija i rizični čimbenici smrtnog ishoda u 194 COVID-19 pacijenata u Wuhanu (65). Prosječna dob svih pacijenata iznosila je 56 godina, 62% bili su muškarci, a među umrlim, prosječna dob je iznosila 69 godina uz 70%-tnu zastupljenost muškog spola. Najčešće početne tegobe bili su febrilitet (94%), kašalj (79%), dispneja (29%), opći umor (23%), mialgija (15%), mučnina, povraćanje i proljevi (5%) (Slika 7). Prosječno trajanje tegoba do hospitalizacije iznosilo je 11 dana, a ukupno prosječno trajanje tegoba od 12 dana (febrilitet) pa do tri tjedna (kašalj). Najčešći komorbiditeti bili su hipertenzija (30% pacijenata), šećerna bolest (19% pacijenata) i koronarna bolest (8% pacijenata). Najčešće komplikacije bile su sepsa (59%), ARDS (31%), srčano popuštanje i/ili infarkt (23%), koagulopatija (19%), primjena mehaničke ventilacije (17%), akutno bubrežno oštećenje (15%, 5% liječeno dijalizom). Univarijatnom analizom, kao prediktivni čimbenici teže kliničke slike, nađeni su limfocitopenija, troponin I, ALP, LDH, feritin, prokalcitonin, PV, CK, kreatinin i IL-6. Multivarijatnom analizom pokazano je da su dob (prosječna dob preživjelih 52 godine a umrlih 69 godina), razina D-dimera  (> 1 µg/mL) i SOFA (severe organ failure assesment) score prilikom hospitalizacije, statistički značajno povezani sa smrtnim ishodom (p< 0,0001 za sva tri parametra).

S obzirom da je epidemija COVID-19 uzrokovana novim virusom i poprimila pandemijske razmjere, jedno od intrigantnijih pitanja predstavlja stopa smrtnosti ove infekcije.

Prema Guanu, smrtnost COVID-19 varira od 0,3% do 10%, a infekcija primarno oštećuje respiratorni, imunološki i koagulacijski sustav (42). Ruan i suradnici našli su da je prosječan udio fatalnih slučajeva COVID-19 oko 1,7% (66). Usporedivši taj udio s ranijim epidemijama koronavirusom, 2003. godine SARS-CoV (smrtnost 9,6%) i 2008. MERS-CoV (smrtnost 34,4%), taj postotak je bitno niži u COVID-19, međutim značajno raste u starijih bolesnika. Najveća serija COVID-19  bolesnika iz Kine, obuhvatila je 44.672 potvrđenih COVID-19 slučajeva (61). U njoj, ukupna smrtnost iznosila je 2,3%, među starijima od 70 godina 8%, a među starijima od 80 godina 15%. U kritično bolesnih, smrtnost je iznosila 49%, nije bilo smrtnih ishoda u djece mlađe od 9 godina niti u bolesnika s blagom ili umjereno teškom bolesti. Smrtnost je bila veća od prosječne u osoba s komorbiditetima, najviša u osoba s kardiovaskularnim bolestima 10%, šećernom bolesti 7%, kroničnim plućnim bolestima i hipertenzijom oko 6%. Guo i suradnici istražili su specifično kardiološki morbiditet pacijenata s COVID-19, koji je iznosio 20-30% uz mortalitet oko 40% (67).

Rastući broj izvještaja (uključujući izvan Kine), upozorava i na druge prepoznatljive  simptome i znakove COVID-19, kao što su učestali tromboembolizmi, anosmija i disguezija.

U COVID-19 jedna od ključnih patofizioloških komponenti je endotelna disfunkcija, koja za posljedicu ima koagulopatiju manifestiranu razvojem tromboembolizama, uključujući cerebrovaskularni inzult, duboku vensku trombozu i plućnu emboliju (68 − 71).

Kao što je već spomenuto, povišena razina D-dimera predstavlja jedan od nezavisnih pozitivnih prediktora smrtnosti COVID-19 (65). U uznapredovalom tijeku COVID-19 često se opisuje i razvoj diseminirane intravenske koagulopatije (DIK) praćene povišenim D-dimerima, niskim fibrinogenom i antitrombinom (72). Kao molekularni biljeg endotelne disfunkcije u nekih COVID-19 bolesnika, nađena je povišena razina von Willebrandovog čimbenika i faktora VIII (73). Povišena razina ATII u cirkulaciji koja je opisana u COVID-19 pacijenata (46), dovodi do dodatnog oštećenja endotela, indukcijom tkivnog faktora, aktivacijom komplementa, što zajedno potiče agregaciju trombocita, gubitak fibrinolize i mikrocirkulacijsku propustljivost (74, 75). U pacijenata s hipertenzijom i šećernom bolesti, koji su najskloniji infekciji SARS-CoV-2, već postoji oštećenje endotela, koje se spomenutim upalnim mehanizmima u COVID-19 dodatno intenzivira uz gubitak barijere krv- pluća, čime se ostvaruje neposredan kontakt krvi i intersticijske tvari, a što onda pogoduje zastoju krvi i trombozi. Hipoksemija uslijed upale, putem aktivacije hipoksija inducirajućeg čimbenika, potiče mikrotromboze plućne mikrocirkulacije (76, 77). Tang i suradnici pokazali su u COVID-19 bolesnika s ARDSom i povišenim D-dimerima (> 3 µg/L), 20% veće preživljenje uz primjenu heparina (niskomolekularnih i nefrakcioniranih) prema pacijentima koji nisu primili heparin, te stoga predlažu primjenu heparina u takvih bolesnika ukoliko ne postoje kontraindikacije (78).

Među novo prepoznatim i novo opisanim kliničkim promjenama u COVID-19 jesu gubitak osjeta njuha i okusa (79). Prevalencija tih simptoma se kreće oko 5%, a pažnje vrijedan je podatak, da navedene tegobe mogu biti prvi i jedini znak u oligosimptomatskih bolesnika.

Točan postotak asimptomatskih osoba, prema jednoj bio je 1% (64), a njihova infektivnost, kao i mogućnost da se ista osoba zarazi u fazi rekonvalescencije, nisu još točno definirani.

U djece, koja su obično rjeđe pogođena (<1% ukupno oboljelih) uz blagu kliničku sliku (64, 80), mogu se razviti vaskulitične promjene, specifično Kawasakijeva bolest (81).

Za sada u literaturi nema velikog iskustva s COVID-19 u trudnica. Prema nekim radovima klinička slika se obično javlja u trećem trimestru i jednaka je ostalim bolesnicima. Iako su opisani slučajevi spontanih pobačaja i preranih porođaja, za sada, nema uvjerljivih dokaza transmisije virusa in utero (82).

Budući se nalazimo usred pandemije, nije moguće predvidjeti potencijalno dugoročne posljedice COVID-19. U prethodnim epidemijama SARS-CoV opisane su sekvele u obliku plućne fibroze, avaskularne nekroze kosti, hiperlipidemije i oslabljene spermatogeneze, stoga je potreban klinički oprez uz dugoročno praćenje oboljelih (83 − 86).