Zašto je gen za 16S odabran kao meta za detekciju bakterija u kliničkim uzorcima? 16S rRNK strukturni je i funkcionalni dio male podjedinice ribosoma u prokariota, stoga svaka bakterija ima barem jednu kopiju 16S gena (neke i do 15), dok u eukariotskoj stanici ovaj gen nije prisutan. Osim toga, 16S gen sastavljen je od naizmjeničnih varijabilnih i nevarijabilnih (konzerviranih) regija. To nam s jedne strane omogućuje dizajniranje univerzalnih, tzv. „eubakterijskih“ početnica, s pomoću kojih možemo detektirati bilo koju bakteriju u kliničkom uzorku budući da se vežu na visoko konzervirane dijelove gena; s druge strane hipervarijabilne regije koje se više ili manje razlikuju između pojedinih bakterijskih vrsta / rodova omogućuju nam identifikaciju patogena.

PCR / sekvenciranje 16S može se raditi izravno iz bilo kojeg primarno sterilnog kliničkog uzorka, osim krvi i bronhoalveolarnog lavata (BAL). Metoda se sastoji od triju koraka. U prvom koraku izolira se ukupna DNK iz kliničkog uzorka. Drugi je korak konvencionalni PCR kojim se detektira, tj. namnaža određena regija gena za 16S (ili cijeli gen ako je potrebno). Kada je PCR negativan, smatramo da u uzorku nije prisutna bakterijska DNK i nalaz pretrage je negativan. Ako je PCR pozitivan radi se treći korak: u svrhu identifikacije patogena određuje se sekvenca namnoženog fragmenta i uspoređuje s nekom od baza koje sadržavaju 16S sekvence poznatih bakterija. Najveća je takva baza GenBank (NCBI) koja trenutačno sadrži više od 45 milijuna 16S sekvenci različitih duljina, dobivenih od velikog broja kliničkih i okolišnih bakterija.

16S PCR-om možemo detektirati DNK patogena u kliničkom uzorku i više dana nakon što je pacijent počeo primati antimikrobnu terapiju, što je slučaj i s drugim molekularnim metodama. No, za razliku od metoda koje ciljaju specifične uzročnike, 16S PCR-om možemo detektirati rijetke vrste i patogene neobičnog fenotipa koje je teško identificirati konvencionalnim fenotipskim metodama. Ovom su metodom tako identificirane mnoge klinički značajne bakterije koje bi prije bile pogrešno identificirane ili neidentificirane iz kliničkih uzoraka. Pomoću 16S možemo lako detektirati i sporo rastuće i nekultivabilne uzročnike. Primjerice Tropheryma whipplei, uzročnik Whippleove bolesti, otkriven je pomoću 16S metode 1992. godine, osam godina prije nego je prvi puta kultiviran. 

Osim navedenih prednosti, 16S metoda ima i određena ograničenja. Nije uvijek moguća precizna identifikacija humanih patogena zbog visoke sličnosti u varijabilnim dijelovima 16S gena među pojedinim bakterijskim vrstama / rodovima.

Rezultat pretrage dostupan je najranije nakon 24 sata (ako je nalaz negativan) ili 36 sati ako je potrebno napraviti identifikaciju sekvenciranjem, što je značajno dulje nego kod većine specifičnih PCR-ova. Također, ovom metodom ne možemo odrediti osjetljivosti bakterija na antibiotike.

Iako je ova metoda u svijetu raširena posljednjih desetak godina, njezino je izvođenje uglavnom ograničeno na velike i / ili referentne laboratorije zbog još uvijek visoke cijene i potrebe za obučenim laboratorijskim osobljem. Uza sve navedene prednosti 16S metode, u usporedbi sa specifičnim PCR-om ona je manje osjetljiva, više podložna problemima s kontaminacijom, skuplja i dulje traje. Pretraga je stoga indicirana u slučajevima kada se zbog prethodne antimikrobne terapije ne uspijeva kultivirati uzročnik, a očekivani su uzročnici isključeni specifičnim PCR-ovima (uključujući komercijalni multipleks PCR) ili kada za očekivanog uzročnika nije dostupan specifičan PCR.

Marija Gužvinec